石胆酸对山羊结肠类器官干细胞增殖与分化的作用机理

雷克儿

肠上皮是机体内外环境的重要屏障，易受内外因素的影响。肠干细胞是肠上皮发挥功能的结构基础，肠干细胞时刻维持肠道稳态和功能发挥。深入了解肠干细胞干性稳态维持机制，对于肠道上皮稳态的维持具有重要的生理意义。肠上皮细胞的更新和分化由肠干细胞协调，一些饮食和代谢因子可以作为生态位信号来控制ISC行为。石胆酸作为后肠道的一种重要代谢物质，被证实参与了肠道稳态的维持。适宜生理浓度的LCA通过下调炎症因子抑制肠上皮细胞凋亡并促进黏膜屏障功能；LCA还能作用于肠干细胞促进其增殖与分化，其如何影响宿主肠道干细胞尚不清楚。自2009年Hans Clevers等利用小鼠LGR5+肠干细胞在体外培养出肠类器官以来，肠道类器官模型被广泛应用于肠道疾病、肠干细胞特性等研究领域。与传统实验模型（2D细胞及动物模型）相比，体外构建的肠道类器官模型包含所有类型的肠上皮细胞且细胞空间分布于机体相似，还具有水、离子吸收和转运等生理功能。肠类器官技术的出现为反刍草食家畜营养代谢研究提供了新思路，本试验结合肠道类器官技术，创新性地构建山羊肠道类器官体外研究模型，解析LCA调控山羊结肠干细胞增殖、分化的分子机制。试验1 山羊回肠/结肠类器官的分离培养与鉴定山羊回肠类器官在不同培养基中生长发育形态不同，在生长培养基中，以球状结构为主，偶有出芽情况；分化培养条件下，表现为多芽结构。结肠类器官在两种培养基中具有相似的生长发育形态。实验结果显示，山羊类器官一般在第2-4天出芽，7-10天发育成熟。培养时间过长时，山羊肠类器官中间区域出现黑色物质。免疫荧光的结果显示在类器官中存在肠干细胞、潘氏细胞、肠上皮细胞、内分泌细胞。试验2 LCA对山羊结肠类器官干细胞生长的影响基于试验1培养的结肠类器官，设置LCA浓度为0 μM、10 μM、50 μM的类器官培养基，经培养后在24h、48 h、72 h、96 h、120 h时间点检测类器官增殖活性；收集第6 day的类器官样品检测干细胞调控信号通路及胆汁酸相关受体基因表达。（1）相较于Control组，10 μM LCA显著提高了结肠类器官的增殖活性（P＜0.05），50 μM LCA则抑制了其活性（P＜0.05）。（2）类器官生长发育形态学分析，10 μM LCA处理后结肠类器官出芽率高，形态较大；50 μM LCA条件下，结肠类器官呈现空泡状，几乎无出芽。5 μM LCA处理组和Control组中的类器官大小、出芽数量以及生长速度保持一致。根据上述实验结果，后续的基因表达实验、转录组实验仅对于Control组、10 μM LCA组和50 μM LCA组进行检测。（3）胆汁酸相关受体基因表达分析。相较于Control组，10 μM LCA显著提高了PXR、TGR5基因的表达量（P＜0.05），但对FXR和VDR的基因表达无显著影响（P＞0.05）。相较于Control组，50 μM LCA组中VDR、TGR5、FXR的基因表达显著下调（P＜0.05）。（4）相较于Control组，两种浓度LCA处理类器官都显著降低对于Wnt信号中的β-catenin、Fzd、LRP的表达（P＜0.05）。LCA对于Notch信号通路的影响：相较于Control组，LCA显著降低了Notch1、Jagged1的表达（P＜0.05），显著提高了OLFM4的表达（P＜0.05）且不同浓度处理间也存在显著差异（P＜0.05）；10 μM LCA组与Control组（P＜0.05）、50 μM（P＜0.05）相比显著提高HES1的表达；Hippo信号通路是近来发现的可以调控肠道干细胞的通路，但10 μM和50 μM LCA处理后LATS1和YAP的表达量都显著降低（P＜0.05）。综上所述，LCA可以通过提高OLFM4的表达促进肠干细胞的增殖，提高HES1的表达促进干细胞向吸收型细胞分化。试验3 LCA对山羊结肠类器官基因表达谱的影响研究基于试验2，收集对照组（Control）和实验组（10 μM LCA和50 μM LCA）结肠类器官RNA用于转录组学分析。生理浓度的LCA（10 μM LCA）抑制细胞凋亡、促进黏膜功能、促进干细胞增殖与分化，高浓度胆汁酸具有细胞毒性，因此选择Control组和10 μM LCA组进行差异表达分析，共筛选出103个上调基因和77个下调基因。KEGG通路分析发现差异表达基因显著性富集在能量代谢、谷胱甘肽代谢、核糖体翻译等相关通路。与谷胱甘肽代谢相关基因CHAC、GST和GCLC，与线粒体功能相关的酶基因如ND3表达量显著上调。GO富集分析发现差异表达基因与线粒体内呼吸电子链传递、NADH酶、氧化还原酶等功能相关。通过筛选差异基因，我们还发现了10 μM LCA显著下调了ATOH1、CBY1和PEDF三种基因，其中CBY1和PEDF与Wnt/β-catenin通路相关，抑制细胞增殖。LCA降低CBY1的表达来维持干细胞的干性，通过降低PEDF表达增强细胞增殖。ATOH1是Notch的下游基因，表达被抑制后促使干细胞向吸收性细胞转化。综上，本研究构建了山羊回肠、结肠类器官的分离培养方法，并且鉴定了干细胞、内分泌、肠细胞和潘氏细胞类型。以结肠类器官为实验材料，探索LCA调控肠干细胞增殖和分化的机制。生理浓度的LCA可以促进类器官生长，提高增殖活性，提高TGR5、PXR胆汁酸受体的基因表达，上调了OLFM4和HES1基因的表达。转录组提示了LCA可能通过影响线粒体、核糖体功能参与肠干细胞调控